海藻糖新型生物分子保护剂

海藻糖简介

海藻糖(Trehalose)也被称作α-D-吡喃葡萄糖基α-D-吡喃葡萄糖苷,由于两个吡喃葡萄糖环的连接发生在糖基的还原末端(α-carbons),不会轻易地被酸水解,并且糖苷键不会被α-糖苷酶分解,所以海藻糖是具有很强的稳定性非还原性双糖。海藻糖的研究已经有近百年的历史,自发现以来,不断从对外界恶劣环境表现出非凡抗逆耐受力的物种中发现海藻糖的存在,从而发现了海藻糖对生物体具有神奇的保护作用,是因为海藻糖在高温、高寒、高渗透压及干燥失水等恶劣环境条件下在细胞表面能形成独特的保护膜,有效地保护蛋白质分子不变性失活,而后更多的研究将海藻糖应用到了食品、化妆品、药品、生物制品的工艺中。

海藻糖在生物制品中的应用

在生物制品的冻干保护剂的制剂过程中,糖类是重要的一类辅料,比如蔗糖、甘露醇、甘露糖、山梨醇、麦芽糖等,其中蔗糖是在生物制品中使用广泛,但由于国际药用辅料协会对生物制品的质量、安全性日趋提高的要求,寻找更好的生物大分子保护稳定剂,提高生物制品的稳定性和质量是各大生物制药公司不断追寻的目标。迄今为止,在国际上,海藻糖已经陆续被使用到各类生物制品的冻干保护中,比如国际重磅生物炸弹药,比如Herceptin?Adcetris?Avastin?Lucentis?Advate?Gazyva?Blincyto?,当中就使用了海藻糖作为核心的冻干保护剂,另外,也在越来越多的人用疫苗中,比如MenAfrivacDengVaxiaHepB?(ShanVac)Influenzae (DPIV)MMR开始使用海藻糖替换血清白蛋白作为保护剂,可以常温条件下干燥存放,不仅可以避免疫苗因为非冷链运输导致的失效问题,而且还能防止因为血源污染导致的乙肝、艾滋病等致命疾病的传播。

海藻糖相比蔗糖具有更加优质保护作用的原因

?1.?海藻糖和蔗糖物理性质比较

性质

海藻糖

蔗糖

Solubility (g/100 g H20, at 20°C)

40.6-68.9?

200

Melting temperature (°C)

210-215

188

Glass transition temperature (Tg, °C)

110-120

65-75

Relative viscosity

1.85

1.3

# Equatorial -OH

8

46

Diffusion coefficient (cm2/s)

1.91 x 10-8

5.89 x 10-8

Density (g/cm3, at 25°C and 85°C)

1.58,1.41

1.59,1.37

Hydration number

11

8

Rate of hydrolysis (s_1, at 25°C)

3.3 x l-15

5.0 x l-n

Stability in extreme pH (% remaining)

>99%

^0%?at pH 3-4

Acrylamide formation

0 mg/mol Asn

98 mg/mol Asn

Calcium dissolution in phosphate buffer

24 ppm

6 ppm

Sweetness

45%

100%

?

1.?玻璃态转变温度Tg

在不同的干燥或失水过程中,包括冷冻干燥和喷雾干燥,海藻糖可轻易地干燥为非晶体材料,并具有高玻璃态转变温度(Tg100°C[12,3]。不同文献中报道的Tg有所不同,导致不同结果的原因是由于不同的检测条件,其中最重要的因素是残余水分含量。Crowe等人所报道的在残余水分含量为0.3%时,Tg111.3°C[4]随着水分的增加,Tg降低,这是水的增塑作用导致的。尽管如此,在含水量相似的情况下,海藻糖的Tg值高于蔗糖(图1)。?

1.?海藻糖和蔗糖玻璃态转变温度(Tg)与含水量(wt%)的相关性[4,5]

2.?水解稳定性

水解速率对活性生物制品的稳定有着深远的影响,因为还原性单糖,如葡萄糖,易于发生美拉德反应(或褐变反应)。海藻糖对于水解的稳定性是因为海藻糖中的糖苷键具有较低的能量(<1 kcal/mol[5,6],而蔗糖中糖苷键的自由能更高(27 kcal/mol),二水化合物晶体的水解温度高达97°C[7,8],而且在弱酸存在的情况下,蔗糖更易于水解产生葡萄糖和果糖,而海藻糖在ph3.0的情况下仍然非常稳定。在另一项研究中,在没有酸催化的条件下,海藻糖的水解速率也明显低于蔗糖:在25°C时,分别为3.3 ×10?15 s?15 × 10?11 s?1[9]。这两种糖类水解速率和温度的相关性如图2所示,而且研究表明这些速率不随pH和离子强度的变化有显著改变。此外,有文献报道蔗糖在冷冻过程中可发生水解,然而海藻糖并没有类似的报告[10-12]

? ? ??

2.?海藻糖和蔗糖水解速率比较。0.1 M PBSpH8.1),温度范围100°C?-240°C[9]

3.?低吸湿性

与此同时,在一些应用中,如片剂制剂,相对于其他糖类,结晶态海藻糖还有一个优势,即他低吸湿性,从而促进药片粘性的降低和稳定性的提高。在海藻糖和蔗糖不同物理性质的比较中,这些性质的不同大约是由于它们构象柔性不同所导致的。大多数二糖,构象受单糖残基间的分子内氢键影响。结晶态下的海藻糖,不存在直接的分子内氢键[13],而在蔗糖内就存在这样的氢键[14]。尽管如此,海藻糖内还是存在间接的通过水分子表现的分子间氢键[13-15],平均键长相对较短(1.825 ?)。因此,相对作用较强[16]。对于海藻糖和蔗糖,环氧原子的角度分别是114.1°116.1°,而糖苷氧原子的角度分别是115.8°114.4°[13-17]。这两种糖类的其他结晶学数据可在这些文献中找到[13,16-18]

3.?不同糖类晶体状态下吸水性。25°C,相对湿度90%[19]

4.?高水合性

海藻糖还有一个明显的特点就是具有较高数量的Equatorial –OH基团,这使海藻糖在水溶液中有更强的相互作用,并更容易把它自己包含在水分子簇中。相反的,蔗糖不能很好的把自己整合在水分子簇中,从而造成了更大的结构[20]。事实上,相对于海藻糖,蔗糖更不容易与水结合。(图4)这一特点的实际意义说明,对于基于蔗糖的配方,在低含水量(如<1%)时,含海藻糖配方更不容易水解。

除以上原因外,两种糖类的性质的不同也可能是由于分子间氢键数量的不同导致的(尤其是在高浓度下)。海藻糖只形成一个这样的键,而蔗糖会形成两个,因此,对于海藻糖会有更多空闲的位点与水分子的氢键结合,从而导致了更高的水合数量[21,22]。随着海藻糖浓度(5-90wt%)的增加,水合数量递减(大约从133)。图4中的这种减少是由于牺牲糖分子附近的水分子造成的,迫使它们通过增加分子内氢键的方式减少对氢键的需求。这种方式形成了一种折叠的构象,进而减少水合数量[21-24]。红外线光谱和激光拉曼光谱等技术用来验证蔗糖分子糖苷键周围的折叠情况,然而这种构象的改变在海藻糖中没有发现[26]

4.?海藻糖和蔗糖水合数量与糖类浓度(wt%)相关性[21]

5.?更低的水扩散系数和更高的粘性

海藻糖和蔗糖的物理性质比较说明了,虽然密度相似,海藻糖具有更低的水扩散系数和更高的粘性[21]。所有性质之间都是紧密联系的。随着密度增加,自由体积减少,所以扩散性降低,粘性增加[26]。蔗糖的扩散系数要高于海藻糖,尤其是在高浓度的情况下:74wt%糖浓度,蔗糖和海藻糖的扩散系数分别是5.89 × 10?81.91 × 10?8 cm2/s。更快的扩散系数是由于蔗糖具有更小的水合数造成的。因为水合的蔗糖在尺寸上更小,所以它更易扩散。然而,在低浓度时,系统中水分子相对显著增多,涉及其中的糖类并不敏感,所以没有发现扩散性的不同。随着系统中糖类流动性限制的增加,粘性预计会增加。事实上,Sola-PennaMeyer-Fernandes[27]的研究表明海藻糖粘性高于蔗糖,并且在更高的浓度下,差距增加。图5中这说明在具有高浓度蛋白的应用中,含海藻糖的配方具有更高的整体粘性。

????????????????????5.?浓度范围在0-1 M,海藻糖和蔗糖相对粘性[25]

另外,在细胞冻存,细胞培养等方面,海藻糖也有相对一般糖类同样具有非常明显的优势,如果您对这方面内容感兴趣,欢迎关注西美杰公众号(xmjsci)后期推送内容,或者致电西美杰客服热线400-050-4006进行咨询。

Pfanstiehl高纯低内毒素注射级海藻糖

美国Pfanstiehl Inc.专注研发与生产注射级高纯度低内毒素海藻糖,并且符合USPEPJPChP等多国药典。产品在FDA备案,DMF为激活状态,在FDA批准的含海藻糖产品中,100%的海藻糖都来自于Pfanstiehl。作为Pfanstiehl在中国区代理商——北京西美杰科技有限公司,将Pfanstiehl高品质的糖类产品带给广大客户解决生物制品冻干保护作用难题的同时,也一直致力于为客户提供高品质的售前售后服务,关注和陪伴国内生物制药企业一起成长,我们现阶段正在积极响应CFDA的辅料关联审评工作,配合使用我们产品的企业尽早通过审评。如需进行产品咨询,请直接联系Pfanstiehl中国代理-北京西美杰科技有限公司(热线电话400-050-4006)。

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